Đậy kín bình và cân. Đun hồn lưu trên cách thủy trong 3 giờ, hoặc 45 phút trong bể siêu âm (350 W, 35 kHz). Cân bổ sung lượng cloroform hao hụt. Lắc đều, lọc nhanh vào bình nón. Lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình gạn 50 ml. Chiết 4 lần mỗi lần 10 mL dung dịch acid sulfuric 0 Hạt mã tiền kích thích hệ thần kinh ngoại vi. Theo các nghiên cứu cho thấy, trong mã tiền có chứa thành phần chất được gọi là strychnin có tác dụng kích thích thần kinh tương đối mạnh, làm tê thần kinh cảm giác, chống viêm, giảm đau và ức chế vi khuẩn rất tốt. Ngoài ra Trong hạt mã tiền có nhiều thành phần, 15% manan, 85% ga-lactan. 4 - 5% chất béo, một heterozìt gọi là loganozit hay loganin (1,5%), có nhiều alkaloid nhưng nhiều nhất là strychnin, bruxin, ngoài ra còn có vomixin, struxin, colubrin α và β. Công dụng của hạt mã tiền: Trị phong thấp. Mã tiền chế chủ trị chứng phong thấp, từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng hạt mã tiền để chữa trị theo nguyên tắc “lấy độc trị độc”. Đây là một kinh nghiệm có giá trị hết sức đặc biệt. Tác dụng chống tê Strychnin và brucin là hai thành phần alcaloid trong hạt Mã tiền có độc tính và tác dụng sinh học mạnh. * Một số đặc điểm của cây Mã tiền 1.3.1. Tên khoa học Strychnos nux-vomica L. Thuộc họ Mã tiền Loganiaceae. 1.3.2. Thành phần hóa học Nhận định chung. Strychnin là một alkaloid được chiết suất từ cây mã tiền (Strychnos nuxvomica) thường thấy ở khu vực châu Á và Châu Úc. Trước đây từng được sử dụng trong các loại thuốc điều trị rối loạn tiêu hóa, nhược cơ, yếu cơ thắt, đái dầm. YTGjm. ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 9130.2018 71 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BRUCIN VÀ STRYCHNIN TỪ HẠT MÃ TIỀN CHẾ BẰNG HPLC STUDY ON EXTRACTION METHOD AND DETERMINATION OF BRUCINE AND STRYCHNINE FROM STRYCHNOS NUX-VOMICA BY HPLC Giang Thị Kim Liên1, Trần Ngọc Đông2, Nguyễn Thị Hoàng Anh3 1 Đại học Đà Nẵng; gtklien 2 Trường Cao đẳng Nguyễn Văn Trỗi 3 Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tóm tắt - Mã tiền Strychnos nux-vomica được biết là nguồn chính của các alkaloid có độc tính cao như strychnin C21H22N2O2 và brucin C23H26N2O4, sử dụng trong y học. Nghiên cứu chiết tách, đánh giá hàm lượng của brucin và strychnin, hai alkaloid quan trọng trong Mã tiền chế là cơ sở cho việc sử dụng hiệu quả vị thuốc này. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu phương pháp chiết brucin và strychnin bằng 3 phương pháp khác nhau. Đánh giá định tính brucin và strychnin trong 3 dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi CH2Cl2MeOH = 50,6, phát hiện các chất bằng cách soi đèn tử ngoại, phun với thuốc thử Dragendoft, thuốc thử vanilin/H2SO4. Hàm lượng brucin và strychnin được phân tích bằng phương pháp lập đường chuẩn với thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Abstract - Strychnos nux-vomica is known to be the main source of highly toxic alkaloids such as strychnine C21H22N2O2 and brucine C23H26N2O4, which are used in medicine. Study on the extraction, evaluation of the content of brucin and strychnin, two important alkaloids, extracted from Strychnos nux-vomica seeds is the basis for effective using of this drug. This article shows the results of extraction of total alkaloid by three different methods, qualitative evaluation of brucins and strychnin in three extractions by thin-layer chromatography method with the solvent of CH2Cl2MeOH=5 detecting substances by ultraviolet light, spraying with Dragendoft reagent and vanillium /H2SO4 reagent, quantitative evaluation by high performance liquid chromatography HPLC methods. Từ khóa - Strychnos nux-vomica; brucin; strychnin; alkaloid; sắc ký lỏng hiệu năng cao. Key words - Strychnos nux-vomica; brucine; strychnine; alkaloid; HPLC. 1. Đặt vấn đề Mã tiền Strychnos nux-vomica được biết là nguồn chính của các alkaloid có độc tính cao như strychnin C21H22N2O2 và brucin C23H26N2O4, sử dụng trong y học. Hạt của nó chứa khoảng 1,5% strychnin, còn hoa khô chứa khoảng 1,023% [1, 2]. Trong hạt Mã tiền có 15% manan, 85% galactan, 4-5% chất béo, một heterosid gọi là loganosid hay loganin 1,5%. Hạt Mã tiền chứa khoảng từ 2,6-3% alkaloid tổng, trong đó strychnin 1,25-1,5% và brucin 1,7% là hai alkaloid chính. Ngoài ra, các alkaloid phụ gồm có vomicin, igasurine [3], α-colubrine, β-colubrine, N-oxystrychnin, 3-methoxyicajine, isostrychnine, protostrychnine, pseudostrychnine, novacine [4]. Bên cạnh alkaloid, các hợp chất khác như loganin, chlorogenic acid cũng được tìm thấy trong hạt Mã tiền. Hạt Mã tiền không được sử dụng làm thuốc uống trong y học do hàm lượng strychnin cao. Do vậy hạt Mã tiền phải được chế biến để loại bớt thành phần alkaloid strychnin tạo ra Mã tiền chế giảm bớt độc tính và có tác dụng điều trị bệnh. Có nhiều cách để tạo Mã tiền chế ví dụ như hạt quả cây Mã tiền được ngâm vào nước vo gạo khoảng 36 giờ, đến khi mềm cạo vứt bỏ vỏ ngoài và mầm, sau đó thái mỏng, sấy khô tẩm dầu mè một đêm, sao đến màu vàng đậm rồi cho vào lọ đậy kín [5]. Thuốc Phong tê thấp Bà Giằng là một bài thuốc chữa bệnh viêm khớp dạng thấp được lưu truyền rộng rãi và lâu đời trong người dân Thanh Hóa cũng như người dân cả nước. Mã tiền chế là một vị thuốc quan trọng có tính quyết định trong bài thuốc này. Cho đến nay bài thuốc được bào chế dưới dạng viên hoàn, tức là các dược liệu kể cả Mã tiền chế được xay thành bột nhỏ, phối trộn với tá dược để tạo ra viên hoàn. Nhằm hiện đại hóa bài thuốc gia truyền này, việc chuyển dạng bào chế thành viên nang cứng dễ sử dụng, dễ bảo quản và tiêu chuẩn hóa, từ các cao chiết dược liệu là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Trong đó nghiên cứu phương pháp chiết, đánh giá hàm lượng của brucin và strychnin trong Mã tiền chế là một nhiệm vụ quan trọng. Bài báo này công bố kết quả nghiên cứu 3 phương pháp chiết Mã tiền chế; đánh giá định tính brucin và strychnin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC, định lượng chúng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. 2. Thực nghiệm Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị - Bột Mã tiền chế do Doanh nghiệp tư nhân Sản xuất Thuốc y học cổ truyền Bà Giằng cung cấp. - Ethanol thực phẩm, nước cất, HCl, H2SO4, NH4OH, Na2SO4 tinh khiết, thuốc thử Dragendoft, thuốc thử Vanilin/H2SO4. - Hệ thống thiết bị HPLC Alliance series 2695, detector PDA 2996 của hãng Waters-Mỹ. - Cân phân tích Adam AAA 160L. Chiết mẫu hạt Mã tiền chế Việc chiết mẫu được thực hiện theo 3 phương pháp khác nhau [6, 7]. a. Chiết với Ethanol 96° - Nước 1 Ngâm chiết 2 kg bột Mã tiền chế với 10 lít ethanol 96° trong 3 tiếng ở nhiệt độ phòng, lọc thu được 6 lít dịch chiết. - Nước 2 Tiếp tục ngâm bã Mã tiền chế với 6 lít ethanol 96° trong 3 tiếng ở nhiệt độ phòng, lọc thu được 4 lít dịch chiết. - Nước 3 Bã Mã tiền chế được tiếp tục ngâm chiết với 6 lít ethanol 96° trong 3 tiếng ở nhiệt độ phòng, lọc thu được 4 lít dịch chiết. Giang Thị Kim Liên, Trần Ngọc Đông, Nguyễn Thị Hoàng Anh 72 Gộp dịch chiết của các lần chiết 1 + 2 + 3 quay cất dưới áp suất giảm để thu cặn chiết, ký hiệu MTE. b. Chiết với ethanol 70° Bằng cách tương tự như trên, ngâm chiết 2 kg bột Mã tiền chế 3 lần với ethanol 70° 10; 6 và 6 lít, mỗi lần 3 tiếng ở nhiệt độ phòng. Gộp dịch chiết của 3 lần chiết, lọc, quay cất dưới áp suất giảm để thu cặn chiết, ký hiệu MTEN. c. Tách alkaloid tổng Ngâm chiết 2 kg bột Mã tiền chế với 13 lít dung dịch HCl 0,5M, lọc thu dịch chiết. Chiết với n-hexan để loại các chất kém phân cực, kiềm hóa pha nước thu được bằng dung dịch NH4OH 25% đến pH = 12, chiết 5 lần với CH2Cl2 mỗi lần 2 lít. Gộp dịch chiết CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu cặn chiết, ký hiệu MTH. Đánh giá định tính và định lượng alkaloid strychnin và brucin a. Đánh giá định tính bằng phương pháp TLC Các cặn chiết MTE, MTEN và MTH được đánh giá định tính bằng sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi CH2Cl2MeOH = 50,6, phát hiện các chất bằng cách soi đèn tử ngoại, phun với thuốc thử Dragendoft, thuốc thử vanilin/H2SO4 b. Định lượng bằng phương pháp HPLC - Xây dựng đường chuẩn Brucin và strychnin chuẩn Merck được cân chính xác 25 mg cho vào bình định mức 25 ml sau đó thêm MeOH cho đến vạch ta được dung dịch gốc. Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,01; 0,1; 0,2; 0,3 và 0,5 mg/ml, sau đó chạy lần lượt các dung dịch có nồng độ trên qua hệ thống HPLC với cột phân tích Sunfire -C18 RP x 250 mm, 5µm. - Thông số của HPLC Pha động Kênh A H2O + 0,1% acid formic; Kênh B Acetonitrile. Tốc độ dòng 1 ml/phút, chạy gradient kênh A từ 80% về 0% trong 30 phút. Detector PDA bước sóng 264 nm brucin; 253,4 nm strychnin. Các nồng độ brucin và strychnin chuẩn đã được đo lặp lại 3 lần, kết quả thu được có sự ổn định rất cao về giá trị tích phân diện tích pic, và thời gian lưu RT. Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp đã lựa chọn cho hệ thống HPLC là phù hợp cho việc phân tích định lượng brucin và strychnin. Kết quả đánh giá định tính strychnin và brucin Hình ảnh các vệt sắc ký của 3 cặn chiết MTE, MTEN, MTH so sánh với strychnin St và brucin Br trên bản mỏng hiện với các phương pháp khác nhau, được trình bày trên Hình 1, 2 và 3. Hình 1. Vệt sắc ký hiện dưới đèn tử ngoại Hình 2. Vệt sắc ký hiện với thuốc thử Vanilin/H2SO4 3. Kết quả và thảo luận Hiệu suất chiết mẫu bằng ba phương pháp Bảng 1. Hiệu suất chiết mẫu Bột Mã tiền Cặn chiết Hiệu suất chế kg g chiết % STT Phương pháp 1 Chiết với ethanol 96° 2 306,25 15,31 2 Chiết với ethanol 70° 2 374,06 18,70 3 Chiết alkaloid tổng 2 216,92 10,85 Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả trung bình được trình bày trên Bảng 1. Kết quả trên Bảng 1 cho thấy phương pháp chiết bột Mã tiền chế với ethanol 70° cho lượng cặn chiết với hiệu suất cao nhất. Hình 3. Vệt sắc ký hiện với thuốc thử Dragendoft Nhận xét Các bản mỏng trên cho thấy các cặn chiết MTH, MTE, MTEN đều có chứa strychnin, brucin và một số alkaloid khác với hàm lượng nhỏ. Ngoài các hợp chất alkaloid, cặn chiết MTE có chứa một số chất kém phân cực, trong khi cặn chiết MTEN chứa các hợp chất phân cực. Đây chỉ là các kết quả định tính, phương pháp HPLC sẽ cho biết hàm lượng 2 alkaloid quan trọng này trong các cặn chiết Mã tiền chế. ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 9130.2018 Kết quả đánh giá định lượng alkaloid brucin và strychnin Xây dựng đường chuẩn cho brucin và strychnin Kết quả phân tích HPLC cho dãy chuẩn của brucin và strychnin được trình bày trên Bảng 2 và Bảng 3, từ kết quả này sẽ tiến hành xây dựng đường chuẩn. Bảng 2. Kết quả phân tích HPLC cho chất brucin Nồng độ mg/ml 0,01 0,1 0,2 0,3 0,5 TT 1 2 3 4 5 Diện tích pic 147933 1804838 3663515 5579296 9745037 Diện tích Pic LT 38785 1800297 3757532 5714768 9629239 RT phút 6,4 6,4 6,4 6,4 6,4 73 Bảng 3. Kết quả phân tích HPLC cho chất strychnin TT 1 2 3 4 5 Nồng độ mg/ml 0,01 0,1 0,2 0,3 0,5 Diện tích pic 79773 1165872 2393406 3579914 6308848 Diện tích pic LT 18247 1159089 2426690 3694292 6229495 RT phút 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 Từ kết quả Bảng 2 và 3, dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu phương pháp hồi quy tuyến tính cấp một để xác định các tham số của phương trình hồi quy y = ax + b. Kết quả phân tích phương sai cho các chất brucin và strychnin được trình bày trên Bảng 4 và Bảng 5. Bảng 4. Bảng phân tích phương sai cho brucin SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,9995 R Square 0,9990 Adjusted R Square 0,9987 Standard Error 132331,7 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F 3143,075467 1,25009E-05 P-value Lower 95% Regression 1 5,50405E+13 5,50405E+13 Residual 3 52535025563 17511675188 Total 4 Coefficients Intercept Nong do Bru mg/ml 5,50931E+13 Standard Error t Stat Upper 95% Lower 99,0% Upper 99,0% -156939 97514 -2 0,205905 -467273 153395 -726512 412634 19572355 349113 56 0.,000013 18461323 20683388 17533220 21611491 Bảng 5. Bảng phân tích phương sai cho strychnin SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,99947 R Square 0,99895 Adjusted R Square 0,99860 Standard Error 90034,2 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F 2848,0458 1,45E-05 Regression 1 2,30867E+13 2,30867E+13 Residual 3 24318461215 8106153738 4 2,3111E+13 Total Coefficients Standard Error Intercept Nong do Stry mg/ml t Stat P-value Lower 95% -108513 66346 -1,6356 0,200447 -319654 102628,6 -496031 279006 12676015 237525 53,3671 1,449E-05 11920105 13431926 11288653 14063377 Kết quả phân tích phương sai cho brucin cho thấy hệ số tương quan R = 0,9995. Phương trình hồi quy tuyến tính đối với brucin được xác định là Y = 19572355. xi – 156939. Đồ thị đường chuẩn brucin được trình bày trên Hình 4. Upper 95% Lower 99,0% Upper 99,0% Kết quả phân tích phương sai cho strychnin cho thấy hệ số tương quan R = 0,99947. Phương trình hồi quy tuyến tính đối với strychnin được xác định là Y = 12676015. xi – 108513. Đồ thị đường chuẩn strychnin được trình bày trên Hình 5. Giang Thị Kim Liên, Trần Ngọc Đông, Nguyễn Thị Hoàng Anh 74 cũng được thực hiện với cùng điều kiện như mẫu chuẩn. Duong chuan Brucin 12000000 10000000 Dien tich pic 8000000 6000000 4000000 2000000 0 0 Nong do mg/ml Series1 Hình 4. Đường chuẩn brucin Duong chuan Strychcin 7000000 6000000 Dien tich pic 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0 Nong do mg/ml Series1 4. Kết luận Hàm lượng hai alkaloid brucin và strychnin thu được từ quy trình chiết 3 là cao nhất, nhưng hiệu suất chiết của quy trình thứ 2 cao hơn quy trình 3. Do vậy, lượng hai alkaloid thu được từ hai quy trình chiết 2 và 3 gần tương đương. Các kết quả này cho thấy để chiết xuất các hoạt chất từ bột Mã tiền chế làm nguyên liệu sản xuất thuốc Phong tê thấp Bà Giằng dạng viên nang cứng thì điều kiện chiết xuất phù hợp nhất là nhiệt độ phòng, dung môi ethanol 70°. Hàm lượng brucin trong 3 dịch chiết MTE, MTEN và MTH tương ứng là 0,63%; 0,85% và 0,79%. Hàm lượng strychnin trong 3 dịch chiết MTE, MTEN và MTH tương ứng là 0,94%; 1,20% và 1,07%. Lời cảm ơn Nghiên cứu này được tài trợ bởi Dự án “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất cao khô bán thành phẩm và thuốc Phong tê thấp Bà Giằng”, mã số CNHD. DASXTN 024 thuộc Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp Hoá dược đến năm 2020 do Doanh nghiệp tư nhân Sản xuất thuốc Y học cổ truyền làm chủ trì, phối hợp với Viện Hóa học thực hiện. Hình 5. Đường chuẩn Strychnin Kết quả phân tích hàm lượng brucin và strychnin Từ các số liệu thu được ở Bảng 2 và 3, dựa vào các phương trình hồi quy thu được từ phương pháp lập đường chuẩn, đã xác định được hàm lượng brucin và strychnin trong bột Mã tiền chế với 3 phương pháp chiết khác nhau nêu trên, kết quả được trình bày ở Bảng 6. Bảng 6. Hàm lượng brucin và strychnin Hàm lượng Hàm lượng brucin % strychnin % TT Dịch chiết 1 MTE Chiết với ethanol 96° 0,63 0,94 2 MTEN Chiết với ethanol 70° MTH Chiết alkaloid tổng 0,85 1,20 0,79 1,07 3 Như vậy, với sự ổn định của việc lặp lại các lần đo cộng thêm sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ brucin, strychnin và diện tích pic thu được trên phổ HPLC, phương pháp này tối ưu cho việc phân tích định lượng brucin và strychcin trong các mẫu nghiên cứu. Các mẫu phân tích TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chinese Plant Names, Strychnos nux-vomica. Linnaeus Sp. pp. 325. [2] Arnold M. D., Harry L., Poisonous Plants of Hawaii, Tokyo, Nhật Bản, 1968. [3] Đỗ Tất Lợi, Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Thời đại, 2004, trang 529. [4] Anil Sah, Gopal L. Khatik, Manish Vyas, Pramod Yadav, “A Short Review on Anticancer Inves of Strychnos nux-vomica”, International Journal of Green Pharmacy, 103, S88, 2016, pp. 87-90. [5] [6] Pasupuleti Sreenivasa Rao, Majeti Narasimha Vara Prasad, “Extraction, Purification and Characterization of Indole Alkaloids from Strychnos wallichiana L. – an Endangered Medicinal Plant from India”, Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, 2008, pp. 63-66. [7] Jun Chen, Yange Qu, Dongyue Wang, Pei Peng, Hao Cai, Ying Gao, Zhipeng Chen, Baochang Cai, “Pharmacological Evaluation of Total Alkaloids from Nux Vomica Effect of Reducing Strychnine Contents”, Molecules, 19, 2014, pp. 4395-4408. BBT nhận bài 8/8/2018, hoàn tất thủ tục phản biện 21/8/2018 Nhà thuốc Ngọc Anh – Trong bài viết này nhà thuốc Ngọc Anh xin chia sẻ đến bạn các Phương pháp chiết xuất Strychnin từ hạt Mã tiền Những điều cần biết Cây mã tiền tên khoa học Strychnos nux vomica L., thân gỗ, vỏ thân màu xám, có lỗ bì, cây non thường có gai nhưng rụng đi khi phát triển. Lá hình trứng, hai đầu hơi nhọn, mọc đối xứng. Gân lá hình cung. Hoa hình ống, màu vàng nhạt, mọc thành xim. Cây mã tiền Strychnos nux- vomica L. có nhiều ở Ấn Độ, Sri lanka, Malaysia, Thái Lan, Bắc Australia, ở ta hiện nay mới thấy mọc hoang ở vùng rừng núi các tỉnh phía nam nước ta. Bộ phận dùng của cây mã tiền là hạt mã tiền được thu hái từ những quả chín. Mã tiền chưa chế biến thường chỉ dùng ngoài làm thuốc xoa bóp chữa nhức mỏi chân tay do thấp khớp, đau dây thần kinh, … Mã tiền đã chế biến theo y học cổ truyền được dùng để chữa tiêu hóa kém, nhức mỏi tay chân, bại liệt, liệt nửa người, chó dại cắn, … Mã tiền được dùng làm nguyên liệu chiết xuất strychnin. Strychnin có tác dụng kích thích phản xạ tuỷ, tăng dẫn truyền thần kinh cơ, thường dùng điều trị các trường hợp tê liệt dây thần kinh, suy nhược, đái dầm. Thuốc gây kích thích tiêu hoá, tăng tiết dịch vị, tăng nhu động ruột, giúp ăn ngon dễ tiêu. Trong hạt mã tiền có 2- 5% alcaloid toàn phần, hai thành phần chính là strychnin và brucin. Ngoài ra còn có một hàm lượng nhỏ các alcaloid khác như vomicin, novacin, colubrin, … Bên cạnh đó, hạt còn chứa một số acid hữu cơ, glycosid, 4- 5% chất béo, nhựa, … Hình ảnh Công thức của Strychnin Strychnin – C21H22N2O2 Tính chất kết tinh thành tinh thể hình lăng trụ trong ethanol, vị rất đắng, nhiệt độ nóng chảy 275- 285 độ C. Dung dịch bão hòa trong nước có pH= 9,5. Độ tan 1g tan trong 6400 ml nước, 3100 ml nước sôi, 182 ml ethanol, 35 ml ethanol sôi, 6,5 ml cloroform. Dạng dùng strychnin thường được dùng dưới dạng muối sulfat làm thuốc. Độc tính mã tiền và strychnin rất độc, với liều 60- 90 mg, strychnin có thể gây liệt hô hấp dẫn đến tử vong. Strychnin nitrat – Tính chất tinh thể hình kim không màu hoặc bột kết tinh trắng, không mùi, vị đắng, rất độc. Độ tan 1 g trong 42 ml nước, 10 ml nước sôi, 150 ml ethanol, 80 ml ethanol ở 60 độ C, không tan trong ether, pH của dung dịch khoảng 5,7. Brucin – C23H26N2O4 Tính chất kết tinh thành tinh thể hình kim trong hỗn hợp aceton nước. Nhiệt độ nóng chảy 178 độ C. Vị đắng, rất độc. Trở nên khan ở 100 độ C. Độ tan 1 g tan trong 1320 ml nước, 750 ml nước sôi, 1,3 ml ethanol, 0,8 ml methanol. Dung dịch bão hòa trong nước có pH 9,5. Brucin nitrat dihydrat – C23H26N2O4. Tính chất tinh thể hình lăng trụ, phân hủy ở 230 độ C. Độ tan dễ tan trong nước hoặc ethanol. Nguyên liệu, dụng cụ cần chuẩn bị Nguyên liệu hạt của cây mã tiền Strychnos nux vomica L. được lựa chọn theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V. Dung môi dầu hỏa Hóa chất vôi bột, natri carbonat, acid sulfuric, acid nitric, than hoạt, giấy đo pH. Thiết bị, dụng cụ Thiết bị máy xay, tủ sấy, hê thống thiết bị chiết nóng, cân đồng hồ 5 kg, cân phân tích, cân kỹ thuật, bơm chân không, phễu lọc buchner, bếp đun cách thủy. Dụng cụ chai thủy tinh 1L, bình gạn 500 ml, giá đỡ bình gạn, cốc có mỏ 100 ml, 250 ml, 500ml, ống đong 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml, giấy lọc. Sơ đồ quy trình chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền 1 Rửa, sấy, xay 2 Trộn đều DL với nước vôi, ủ 24h, làm tơi, khô 3 Chiết nóng 4 Lắc dịch chiết với dung dịch acid, gạn, lọc 5 Điều chỉnh đến pH 10- 11, để kết tủa, lọc, rửa 6 Hòa vào nước, đun nóng. Thêm acid đến pH 4- 4,5, để kết tinh, lọc. 7 Tẩy màu, lọc 8 Điều chỉnh đến pH 10- 11, để kết tủa, lọc, rửa. 9Hòa vào nước, đun nóng. Thêm acid đến pH 4- 4,5. Để kết tinh, lọc, sấy. Mô tả quy trình chiết xuất Chuẩn bị nguyên liệu Hạt mã tiền, chọn được loại tốt hàm lượng khoảng trên 1%, sấy khô ở 60- 80 độ C, xay thành bột khô. Cân bột mã tiền. Kiềm hóa dược liệu Mã tiền được trộn đều với dung dịch nước sữa vôi 10%, trộn kỹ cho dược liệu được tiếp xúc, thấm đều và thành khối bột ẩm đồng nhất. Ủ bột ẩm trong khoảng 24 giờ. Sau đó làm tơi và hong khô, cho vào khay inox sấy ở 60-700C. Sữa vôi là tác nhân kiềm hóa dược liệu, có tính base trung bình. Đây là một nguyên liệu với ưu điểm là sẵn có và rẻ tiền. Đồng thời quá trình ủ để làm ẩm dược liệu còn có vai trò làm trương nở và rộng khe tế bào, giúp tăng tốc độ khuếch tán hoạt chất, tăng hiệu suất chiết. Tỷ lệ giữa dung dịch sữa vôi với lượng dược liệu đem đi chiết, hay thời gian ủ nếu ngắn sẽ không đủ để kiềm hóa hết alcaloid, ngược lại quá lâu sẽ tốn thời gian có thể ảnh hưởng đến chất lượng của giai đoạn kiềm hóa dược liệu. Sau kiềm hóa, alcaloid trong dược liệu tồn tại ở dạng base. Chiết xuất Nguyên tắc chiết Chiết bằng dung môi dầu hỏa với phương pháp ngâm nóng ở 90-1000C. Đây là phương pháp ngâm trên nhiệt độ phòng, nhằm rút ngắn thời gian chiết với nguyên tắc chung cho dược liệu đã chia nhỏ tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, hết thời gian ngâm tiến hành rút lấy dịch chiết, ép bã lấy dịch ép, để lắng gạn hoặc lọc lấy dịch trong. Số lần chiết 2- 3 lần. Thời gian chiết 1,5 – 2 giờ/ lần. Phương pháp chiết xuất ngâm có nhiều ưu điểm như đơn giản về thiết bị, phương pháp, kiểm soát quy trình; thích hợp cho nhiều loại dược liệu, nhiều loại dung môi; dễ nâng quy mô. Tuy nhiên bên cạnh đó, phương pháp cũng có nhược điểm năng suất thấp, thao tác thủ công, chiết nhiều lần sẽ gây tốn dung môi, thời gian, dịch chiết có thể loãng. Tiến hành Cho dược liệu đã kiềm hóa vào vào thiết bị chiết nóng, thêm dầu hỏa, khuấy trộn bằng đũa thủy tinh để dung môi tiếp xúc tốt với mã tiền đã kiềm hóa. Rồi cho lên bếp cách thủy và lắp hệ thống ống sinh hàn. Cấp nhiệt để đảm bảo nhiệt độ 90-1000C. Rút dịch chiết sau khi chiết đủ thời gian quy định. Tiến hành chiết lần 2 và lần 3 có thêm dung môi mới. Với dung môi chiết xuất là dầu hỏa dung môi không phân cực, dễ hòa tan alcaloid dạng base, tuy nhiên chúng dễ gây cháy nổ. Có nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, như Loại dung môi chiết tỷ lệ dung môi/ dược liệu. Tỷ lê này tăng sẽ làm cho lượng hoạt chất hòa tan tăng, tăng hiệu suất chiết, nhưng nếu dùng nhiều quá sẽ gây loãng dịch chiết, dẫn đến khó thu sản phẩm, tốn năng lượng thời gian loại dung môi, dịch lẫn nhiều tạp. Số lần chiết. Tăng số lần chiết sẽ tăng hiệu suất chiết khi dược liệu được tăng tiếp xúc với dung môi mới, nhưng chiết nhiều lần sẽ ảnh hưởng đến độ ổn định của hoạt chất, hoặc gây dịch chiết loãng. Nhiệt độ chiết. Nhiệt độ tăng sẽ tăng độ tan, khuếch tán hoạt chất, rút ngắn thời gian chiết và tăng hiệu suất chiết, tuy nhiên cùng với đó có thể tạp chất cũng tăng tan, dễ bay hơi và hao hụt dung môi. Thời gian chiết. Thời gian chiết quá lâu, tỷ lệ hoạt chất không tăng, ngược lại sẽ tăng tỷ lệ tạp chất. Phân lập alcaloid toàn phần Tạo muối sulfat tan trong nước của alkaloid Cho khoảng 300 ml dung dịch H2SO4 1% vào chai thủy tinh nút kín, lắc kỹ, liên tục 15’ để tăng tiếp xúc giữa 2 pha, tăng hiệu suất chiết. Để yên cho phân lớp. Sau đó gạn lớp acid và phần nhũ hóa vào cốc có mỏ 500ml. Pha dầu hỏa có thể tái sử dụng làm dung môi chiết cho mẻ sau. Ở giai đoạn này có thể loại một số tạp chất thân dầu như chất béo, nhựa, … Dịch thu được lọc trong để loại bỏ những tạp chất lơ lửng có trong dịch chiết. Tạo tủa alkaloid toàn phần Lớp nước acid ở trên được thêm dung dịch Na2CO3 bão hòa đến khi pH 10- 11. Lượng dung dịch natri carbonat bão hòa được sử dụng với một lượng vừa đủ tùy theo lượng alcaloid có trong dịch chiết. Các alcaloid sẽ kết tủa ở dạng base. Lọc hoặc vẩy ly tâm lấy tủa. Dùng nước rửa sạch tủa, thu lấy alcaloid toàn phần. Phương pháp tinh chế alcaloid được sử dụng ở đây đó là chuyển qua lại nhiều lần giữa dạng base và dạng muối. Phân lập strychnin Nguyên tắc Hai thành phần chủ yếu trong alcaloid toàn phần của hạt mã tiền lá strychnin và brucin. Muối strychnin nitrat ít tan trong nước độ tan 1/42, brucin nitrat dễ tan và khó kết tinh trong nước. Do vậy, phân lập strychnin từ alcaloid toàn phần bằng phương pháp kết tinh ở dạng muối nitrat trong nước. Loại brucin dựa vào độ tan khác nhau của các muối. Muối strychnin nitrat sẽ kết tinh lại, còn muối brucin nitrat sẽ ở phần nước cái. Tiến hành Hòa tủa alcaloid vào một lượng nước vừa đủ ngập tủa nhằm phân tán tủa, pha loãng dung dịch HNO3 sẽ cho vào lúc sau, giúp tủa tiếp xúc với dung dịch acid một cách đều, tránh hiện tượng acid cục bộ, đun trong nồi cách thủy, vừa khuấy vừa nhỏ dần dung dịch HNO3. 3% khoảng 20ml cho đến khi tủa tan hết và dung dịch đạt pH= 4 – 4,5 chú ý nếu đủ pH mà tủa vẫn chưa tan hết thì phải bổ sung thêm nước cho đến khi tan hết do hỗn hợp quá đậm đặc, nếu dung dịch bị loãng thì phải cô bớt để tạo dung dịch bão hòa. Để kết tinh qua đêm sẽ thu được strychnin nitrat tinh thể hình kim, thường kết thành chùm. Lọc lấy tinh thể qua phễu buchner nhỏ. Rửa tinh thể bằng nước lạnh dùng ít nước, tránh hòa tan strychnin nitrat, làm giảm hiệu suất. Loại bỏ nước cái, thu strychnin nitrat thô. Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình tạo muối nitrat của alcaloid như nhiệt độ luôn nóng đều đặn, tránh bị thay đổi nhiều trong quá trình, khuấy trộn HNO3 để tăng tiếp xúc đều, thể tích nước khi phân tán nếu quá ít sẽ không đủ phân tán và hòa tan tủa, quá nhiều sẽ gây mất sản phẩm do không tủa hết lại được, thời gian đun trong nồi cách thủy quá lâu sẽ khiến nước bị bốc hơi. Thử brucin nhỏ 1 giọt dung dịch HNO3. đặc vào 1 vài hạt tinh thể sản phẩm strychnin, nếu có brucin sẽ thấy xuất hiện màu đỏ hoặc hồng. Tẩy màu và kết tinh lại Trước tiên phải hòa tan nóng tinh thể strychnin nitrat thô vào một lượng nước vừa đủ, đun trong nồi cách thủy, khuấy cho tan hết. Sau đó thêm than hoạt, khuấy 10- 15 phút. Các dụng cụ phải tráng hoặc nhúng nước nóng để tiến hành lọc nóng, rửa bã bằng nước cất sôi nước rửa đồng thời là nước tráng cốc. Làm nóng dụng cụ, lọc nóng lấy dich trong vì nếu nguội có thể sẽ gây kết tinh strychnin nitrat lẫn theo tạp than hoạt. Chuyển từ dạng muối sang dạng base Dùng dung dịch Na2CO3 bão hòa cho tác dụng với dịch lọc trên, kiềm hóa dịch lọc đến pH = 10 -11. Để nguội cho tủa hết. Lọc lấy tủa base, rửa tủa bằng nước cất. Loại bỏ nước cái và nước rửa. Điều chế strychnin sulfat Cho một lượng nước vào tủa trên sao cho vừa đủ ngập tủa, đun trong nồi cách thủy, vừa khuấy vừa thêm dung dịch H2SO4 3% cho đến khi tủa tan hết và dung dịch có pH = 4 – 4,5. Để kết tinh qua đêm. Lọc lấy tinh thể, rửa bằng nước lạnh. Sấy ở 60 – 700C thu được strychnin sulfat tinh khiết, kết tinh dạng pentahydrat. Bảo quản trong bao bì kín, tránh ánh sáng. An toàn lao động Hệ thống thiết bị chiết nóng dễ gây bỏng cho người thao tác Dầu hỏa là dung môi độc, dễ cháy, có mùi khó chịu Acid sulfuric đặc gây bỏng sâu, nguy hiểm, acid sulfuric loãng gây kích ứng da Acid nitric dễ bay hơi, độc, kích ứng niêm mạc. Tài liệu tham khảo Separation and Purification of Strychnine from Crude Extract of Strychnos nux-vomica L. by High-Speed Countercurrent Chromatography, tandonline, truy cập ngày 4/5/2023. Xem thêm Phương pháp tổng hợp Aspirin trong phòng thí nghiệm m BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐAI HOC D ươc HÀ NÔI ĐỖ THỊ HÀ 16. ý o p c 1'í' Tff .\ IH Ư -V IE S lĩ-c n k NGHIÊN CỨU CHIẾT STRYCHNIN SULFAT BANG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩK H O Ả 2000 - 2005 - Ngưòi hướng dẫn PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị - Nơi thực hiện Bộ môn Công nghiệp dược Trường ĐH Dược Hà Nội - Thòi gian thực hiện Tháng 02 - 05/2005 HÀ NỘI, 05 - 200p f . rtt w & Ị v_ M \U - Á LỜI CẢM ƠN Trong 3 tháng thực hiện khoá luận, vói sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo và các bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp “ Nghiên cứu chiết strychnin sulfat bằng ethanol Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới - PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. - Các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm. Hà Nội, ngày 28/05/2005. SINH VIÊN Đỗ Thị Hà MỤC LỤC Trang CHÚ GIẢI CHỮVIÊT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 01 PHẦN 1 - TỔNG QUAN 02 â y Mã tiền 02 Đặc điểm thực vật 02 Phân bố và sinh thái 03 - Bộ phận dùng và thành phần hoá học 04 n g dụng 05 -Strychnin 06 Công thức hoá học 06 - Tính chất 06 - Định tính, định lượng 08 - Tác dụng dược lý và ứng dụng 08 1 .3 - 09 Các phương pháp chiết xuất alcaloid guyêntắc chung 09 - Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết 13 1 .5 - Chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền 13 - Phương pháp chiết xuất strychnin ở Việt Nam 13 - Phương pháp chiết xuất strychnin trên thế giói 14 PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15 - Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 15 - Nguyên vật liệu 15 2 .1 .2 - 15 Phương pháp thực nghiệm - Kết quả thực nghiệm và nhận xét 22 Định lượng strychnin trong nguyên liệu hạt mã tiền 22 - Chiết xuất strychnin bằng ethanol 25 - Chiết xuất strychnin bằng dầu hoả 34 - Kiểm nghiệm thành phẩm strychnin sulíat 37 PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 3 .1 - Kết luận 40 - Đề xuất 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT - Bh Bão hoà - Dd Dung dịch - Dm Dung môi - DĐVN Dươc Điển Viêt Nam ĐẶT VẤN ĐỀ Alcaloid là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt, đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo. Strychnin là một alcaloid được dùng trong điều trị với tác dụng chính là kích thích thần kinh trung ương, mặc dù hiện nay strychnin ít được dùng trong điều trị nhưng lại rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu cách tác dụng của các thuốc chống co giật [6]. Hiện nay ở nước ta, xí nghiệp dược phẩm trung ương II đang chiết strychnin bằng dầu hoả. Dung môi này có ưu điểm là chiết chọn lọc nên dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế và cho hiệu suất cao. Tuy nhiên do độ tan của strychnin trong dung môi này rất thấp nên phải chiết nóng ở 100°c do đó đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng nồi hơi, nồi chiết 2 vỏ, đồng thcd dầu hoả là dung môi dễ cháy. Các điều kiện chiết xuất này không phải cơ sở nào cũng đáp ứng được. Trong phương pháp chung để chiết alcaloid thì ngoài chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ không phân cực còn có phương pháp chiết alcaloid bằng các dung môi phân cực nước hoặc các dung môi trộn lẫn vói nước. Ở Việt Nam, ethanol là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm. Ethanol có khả năng hoà tan alcaloid ở cả dạng base lẫn dạng muối. Nhược điểm của ethanol là dung môi không chọn lọc với alcaloid, nó hoà tan nhiều tạp chất khác như sắc tố, nhựa làm cho quá trình tinh chế khó khăn. Tuy nhiên hạt mã tiền có thể sử dụng ethanol để chiết vì nó chứa ít tạp sắc tố, nhựa nên không ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. Mặt khác độ tan của strychnin trong ethanol rất cao, nên có thể chiết ở nhiệt độ thường. Chúng tôi đặt vấn đề “nghiên cứu chiết strychnin bằng ethanol” và so sánh với phương pháp chiết bằng dầu hoả để có thể thực hiện chiết strychnin từ hạt mã tiền với các thiết bị đơn giản mà vẫn đảm bảo hiệu suất chiết so vói chiết bằng dầu hoả. Mục tiêu của khoá luận là - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất strychnin sulíat bằng ethanol, xác định các thông số chiết xuất Độ cồn, nhiệt độ, thời gian. - So sánh hiệu suất chiết xuất strychnin sulíat bằng hai phương pháp chiết xuất vói dm ethanol và dm dầu hoả. 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN - Cây Mã Tiền Strychnos nux-vomica L. - Đặc điểm thực vật +Strỵchnos nux - vomica L.\ Cây Mã tiền. Cây gỗ, thân đứng, cao 5 - 12m. v ỏ màu xám có lỗ bì. Cành nhẩn, không có móc, đôi khi có gai ở kẽ lá. Lá mọc đối, gốc tù đầu nhọn, dài 6 - 12m, rộng 3,5 8,5cm, nhẵn và dai, mặt trên xanh bóng có 5 gân hình cung nỗi rõ ở mặt dưới. Cụm hoa hình ngù mọc đối ở đầu cành, có 1 - 2 đôi lá có lông mịn. Hoa nhỏ hình ống, màu trắng hoặc vàng nhạt, có 5 cánh hoa hàn liền thành một ống dài 1 - l,2cm, nhị 5, dính ở phía trên ống tràng. Bầu hình trứng nhẵn. Quả thịt hình cầu, đường kính 3 5cm, vỏ cứng, nhẵn bóng, khi chín màu vàng cam chứa cơm quả màu trắng và 1 - 5 hạt hình đĩa dẹt, đường kính 2 - 2,5cm, dày 4 - 4,5mm, một mặt lồi, một mặt lõm có lông mượt toả đều từ giữa ra màu xám bạc. [4, 6] Mùa hoa tháng 3 - 4 . Mùa quả tháng 5 - 8 . Ngoài cây Mã tiền Strychnos nux-vomica L. ở nước ta còn có một số loài mã tiền dây leo thân gỗ khác ♦ Strychnos vanprukii Craib. = s. quadrangularìs Hill., s. nitida Gagnep. mã tiền cành vuông, dây vuông. Dây leo, thân gỗ, dài 5 - 20m, có móc, xếp từng đôi một, vỏ thân màu nâu. Cành non có 4 cạnh nhẵn. Lá hình mác, mọc đối, màu xanh bóng, dài 7 - 12cm, rộng 2,5 - 5,5cm, gốc thuôn, đầu nhọn, có 3 gân, gân phụ nhiễu tạo thành mạng xít nhau. Cụm hoa hình chuỳ dài 2 - 4cm, mọc ở kẽ lá. Hoa mẫu 5, tràng màu vàng nhạt. Quả thịt hình cầu, đường kính 4 - 5cm, khi chín màu vàng cam có 1 - 6 hạt. [4, 7] ềStrỵchnos ignatii Bergius = s. hainanensỉs Merr et Chun cây đậu gió, dây gió. Dây leo, thân gỗ dài 5 - 20m, dựa vào cây khác bằng móc đơn ở kẽ lá. v ỏ thân màu nâu hoặc xám nhạt, có nhiều lỗ bì. Cành tròn nhẵn. Lá mọc đối, hình trứng hoặc thuôn, dài 6 - 17cm, rộng 3,5 - 7cm, đầu nhọn gốc tròn, hai mặt lá nhẵn có 3 2 gân toả từ gốc. Cụm hoa hình chuỳ mọc ở kẽ lá thường ở những lá đã rụng dài 2 2,5cm, cuống hoa có lông. Hoa mẫu 5, tràng màu trắng hoặc vàng nhạt. Quả hình cầu, đường kính 6 - 20cm, khi chín màu vàng có 4 - 10 hạt, hình elip dẹt mặt lõm mặt lồi, phủ lông dài màu vàng xám, mép hạt có một đường gờ nổi chạy vòng. [4, 7] ♦ Strychnos axilỉaries Coỉebr. Mã tiền hoa nách. Cây nhỏ mọc đứng hoặc leo cao 5 - 20m, cành đen đen có móc đơn ở kẽ lá. Lá có phiến đa dạng hình tròn đến thon, dài 3 - 9cm, không lông trừ lông ở mặt dưới, gân chính 3, cuống dài 2 - lOmm, có lông hoặc không. Xim ở nách lá có lông, cuống hoa ngắn, đài cao lmm, tràng có ống cao 3,5mm, nhị 5, bầu không lông. Quả mọng hình cầu, đường kính 1 - 2cm, khi chín màu đỏ cam, có 1- 2 hạt không lông, đường kính 10 - 12mm. [4,7] +Strychnin umbellata Lour. Merr. Mã tiền hoa tán. Cây nhỡ đứng hoặc leo, không mấu, không gai, cành tròn không lông. Lá có phiến nhỏ, dài 2,5- 8cm, rộng 2 - 4,5cm, không lông, cuống dài 1 - 5mm, không lông. Chuỳ hoa ở nách lá và ngọn cành, dài 3 - 7cm, hoa mẫu 4 - 5 , đài nhỏ, tràng trắng nhỏ, cao 4 - 5mm. Quả hình cầu, đường kính 1 - 2cm, có 1 - 3 hạt hình đồng tiền. [4, 7] iStrychnos cathayensis Merr. Mã tiền Trung Quốc, Mã tiền Cát Hải. Cây nhỡ, leo, mấu từng cặp, cành màu nâu có lông mịn. Phiến lá thon, dài 6 lOcm, rộng 2 - 4cm, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới mờ, có ít lông hay không lông. Có 3 gân từ gốc, cuống có lông mịn. Chuỳ hoa ờ nách lá và ở ngọn cành, cao 3 - 4 cm, trục có lông, hoa mẫu 5, đài nhỏ, tràng trắng nhỏ, cao 4 - 5mm. Quả mọng, tròn, đường kính 1 - 2cm, có 3 - 7 hạt. [4, 7] Y học cổ truyền sử dụng hạt của các loài mã tiền này như hạt của cây Mã tiền Strychnos nux-vomica L., nhưng hàm lượng strychnin trong hạt của cây Mã tiền là cao nhất và là nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất strychnin. - Phân bố và sinh thái Chi Strychnos L. có khoảng 150 loài trên thế giới, ở Việt Nam có gần 20 loài, hầu hết là những cây dạng bụi trườn, dây leo gỗ và chỉ có ít loài là cây gỗ trong đó có cây Mã tiền. [6] 3 Cây Mã tiền phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á bao gồm Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Bắc Malaysia, Mianma, Thái Lan, Bắc úc, Lào, Camphuchia, Việt Nam. Ở Việt Nam, cây Mã tiền chỉ thấy mọc hoang ở các vùng rừng núi phía nam, nhiều nhất ở Khánh Hoà, Bà rịa-Vũng Tàu, Bình Thuận, Ninh Thuận, Gia Lai và Đắc Lắc. Các loài Mã tiền khác phân bố ở hầu khắc các tỉnh miền núi nước ta Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoà Bình, Bắc Giang, Sơn La, Nghệ An, Quảng Trị...đặc biệt có nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên, Thuận Hải, Đồng Nai, Kiên Giang, riêng loài strychnos cathayensis Merr. mới gặp ở tỉnh Quảng Trị. [4, 6] Sinh thái Mã Tiền thuộc loại cây nhiệt đới điển hình. Cây thích nghi ở vùng có nhiệt độ trung bình năm 24 - 26°c trở lên. Cây ưa sáng, chịu được khí hậu khô nóng, thường mọc ở rừng thưa, rừng nửa rụng lá hoặc rừng kín thường xanh ở đai thấp, dưới 500 m. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm. Cây có khả năng tái sinh cây chồi sau khi bị chặt. Ở các vùng đồi ven biển thuộc tỉnh Khánh Hoà, Đồng Nai...có đến trên 50% là cây chồi. Cây mọc từ hạt phải sau 7 - 1 0 năm mới có hoa quả. [6] - Bộ phận dùng và thành phần hóa học - Bộ phận dùng Hạt, thu hái từ quả chín, đã phơi hoặc sấy khô. Loài Strychnos nux - vomica L. hạt hình đĩa dẹt, hơi dày lên ở mép, một số hạt hơi méo mó, cong không đều, đường kính 1,2 - 2,5cm, dày 0,4 - 0,6cm, hoi bóng, màu xám nhạt đến vàng nhạt. Hạt không mùi, vị rất đắng. [5] - Thành phần hoá học Hạt Mã tiền Strychnos nux - vomica chứa nhiều chất thuộc các nhóm -Acaloid 2-5% Strychnin chiếm gần 50%, còn lại chủ yếu là brucin, còn khoảng 2-3% là các alkaloid phụ khác như a-colubrin, P-colubrin, vomicin, novacin, pseudo strychnin...[4] 4 Strvchnin Rị = Rọ = -H Brucin R , = R 2 = -OCH3 oc-colubrin R , = H; R2 = -OCH3 p-colubrin Rị = OCíỉ3; R2 = -H. Ì a ^ n -cm , Rị = R2 = -0 CH3 R3 = -H N o v a xin =R2 = -H NH Ỵ Ỵ A cr ^ 'o - ^ o Pscudosừychnin Ngoài alcaloid, trong hạt còn có chất béo 4 - 5%, acid igasuric = acid clorogenic, acid loganic, stigmasterin, cycloarteroi và một glycozit là loganin = loganozit Loganin có nhiều trong cơm quả. Trong lá có khoảng 2% và trong vỏ thân trên 8% alkaloid nhưng chủ yếu là brucin. Các loài mã tiền khác hiện nay đang khai thác có tỷ lệ alkaloid toàn phần cũng như tỷ lệ strychnin khác nhau. Hạt mã tiền sử dụng làm thuốc phải chứa không ít hơn 1,2% strychnin tính theo dược liệu khô kiệt. [5] - ứng dụng Hạt mã tiền được dùng trong cả y học cổ truyền và y học hiện đại. 5 Y học cổ truyền sử dụng hạt mã tiền đã qua chế biến gọi là mã tiền chế để chữa tiêu hoá kém, ăn uống không biết ngon, phong thấp nhức mỏi tay chân, bại liệt, liệt nửa người, di chứng bại liệt trẻ em, trị đau dây thần kinh, liệt do rượu, liệt não do có nguồn gốc tuỷ, tiêu khí huyết tích tụ trong bụng. Mã tiền chưa chế thường chỉ dùng ngoài làm thuốc xoa bóp chữa nhức mỏi tay chân do thấp khớp, đau dây thần kinh, sử dụng dạng cồn thuốc, dùng riêng hoặc phối hợp với ô đầu phụ tử. Y học hiện đại Hạt mã tiền là nguyên liệu để chiết xuất strychnin. Strychnin thường dùng dưới dạng muối sulíat hoặc nitrat để chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, liệt dương, dùng làm thuốc kích thích hành tuỷ trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hoá. [4, 6,7]. - Strychnin Strychnin thường được dùng dưói dạng strychnin sulfat. - Công thức hoá học .H2 C2iH22N20 22. H2S 0 4. 5H2ơ Phân tử lượng 856,93 Tên khoa học Strychnidin_10 on sulíat penta_hydrat. - Tính chất Lý tính Tinh thể hình kim không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi, vị rất đắng. Bị mất nước kết tinh ở 100°c. Độ chảy khi khan khoảng 200°c bị phân huỷ. 6 Độ tan lg tan trong 35ml nước, 7ml nước sôi, 81ml ethanol, 26ml ethanol ở 60°c, không tan trong ether, khó tan trong cloroíorm. - Hoá tính ♦ Tính chất chung của alkaloid - Tính base yếu + Tác dụng với các acid tạo muối tương ứng Alcaloid = N + HC1 - ► [Alcaloid = N] . HC1 Muối Hydroclorid + Kết hợp với kim loại nặng Hg,Bi,Pt. •. tạo ra muối phức. - Phản ứng vái thuốc thử chung của alkaloid + Phản ứng tạo tủa Tạo tủa rất ít tan trong nước với các thuốc thử thuốc thử Mayer K2HgI4, thuốc thử Bouchardat iodo - iodid, thuốc thử Dragendorff KB1I4... Phản ứng tạo tủa rất nhạy, cho phép phát hiện có alkaloid trong dược liệu hay không. [4] Tạo tủa ở dạng tinh thể vói dung dịch vàng clorid, dung dịch Platin clorid, dung dịch nước bão hòa acid picric... [4] + Phản ứng tạo màu Ngoài phản ứng tạo màu vói các thuốc thử tạo màu chung của alcaloid như acid sulíuric đậm đặc d =1,84, acid nitric đậm đặc d =1,4, thuốc thử Frohde, thuốc thử Marquis, thuốc thử Mandelin...[4], strychnin còn có phản ứng tạo màu đặc biệt đó là phản ứng OTTO 7 Brucin không cho phản ứng này vì có nhóm - OCH3 khoá phản ứng. - Định tính, định lượng - Định tính Định tính strychnin sulfat theo DĐVNIII Có thể chọn một trong 2 nhóm định tính sau Nhóm 1 B, c và D. Nhóm 2 A và D. A Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của strychnin sulíat chuẩn. B Trong phép thử "tạp chất liên quan" vết chính của dung dịch thử phải giống về vị trí, màu sắc và kích thước so với vết chính của dung dịch đối chiếu. C Hoà tan 50mg chế phẩm trong 5ml nước, thêm 0,1 ml amoniac đậm đặc và chiết bằng 5ml cloroíòrm. Bốc hơi dịch chiết cloroíorm đến cạn trên cách thuỷ. Thêm vào cắn 0,1 ml acid sulíuric đậm đặc và một tinh thể Kali dicromat, xung quang tinh thể có màu tím, màu đỏ, màu vàng khi lắc. D Chế phẩm cho phản ứng của ion sulfat. - Định lượng Theo DĐVNIII. Hoà tan 0,500g chế phẩm trong 25ml acid acetic khan, thêm lm l alhydric acetic. Định lượng bằng dung dịch acid perclorid 0,1N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế hoặc bằng chỉ thị xanh malachit. lml dung dịch acid perclorid 0,1N tương đương với 76,70mg - Tác dụng dược lý và ứng dụng - Tác dụng dược lý Strychnin được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá vào máu cả trong huyết tương và hồng cầu, và nhanh chóng chuyển từ máu vào các mô. Strychnin kích thích tất cả 8 các phần của hệ thần kinh trung ương nhưng kích thích tương đối mạnh hơn trên tế bào vận động, đặc biệt là trên tuỷ sống theo cơ chế Trong synap của hệ thần kinh trung ương có hai loại receptor có chức năng đối lập nhau đó là receptor kích thích và receptor ức chế. Receptor glycin là một trong những loại chính của receptor ức chế và nó bị khoá bởi strychnin. Kết quả là các thông tin được truyền đi mạnh hơn rất nhiều trong cung phản xạ mà bình thường các thông tin này bị khử bởi tác dụng sau sinap của glycin. Strychnin kích thích những khả năng về trí não, làm tăng những cảm nhận về xúc giác, thính giác, vị giác và cơn đau. Strychnin kích thích tim mạch, làm tăng lượng epinephrine từ đó làm tăng huyết áp do sự kích thích trực tiếp của hệ thần kinh giao cảm trên cơ trơn động mạch. Tác dụng này rất có ý nghĩa trong điều trị một số bệnh tim mạn tính, đặc biệt trong bệnh viêm cơ tim. Nó cũng được coi là có ích trong điều tri giảm thị lực do ngộ độc, đặc biệt là ngộ độc nicotin. [6] Strychnin kích thích sự bài tiết nước bọt và dịch vị, tăng tốc độ chuyển của thức ăn sang ruột gây ra sự thèm ăn và giúp dễ tiêu. Tuy nhiên nếu dùng luôn sẽ gây ra biến loạn tiêu hoá, biến loạn co bóp dạ dày. [9] Strychnin liều nhỏ làm chậm mệt mỏi, tiếp theo là giai đoạn ức chế hoạt lực cơ. Strychnin được coi là có ích trong điều trị những bệnh co thắt khác nhau như múa giật, hen, động kinh. - ứng dụng Strychnin thường được dùng dưới dạng muối sulíat hoặc nitrat chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, suy nhược, viêm dây thần kinh do nghiện rượu, say rượu cấp, đái dầm, liệt dương. Sử dụng làm thuốc kích thích hành tuỷ trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hoá. [4, 7] - Các phương pháp chiết xuất alcaloid - Nguyên tắc chung Trong nhóm các hợp chất tự nhiên do alcaloid là nhóm chất có các đặc trưng lý hoá chung nên để phân lập chúng khỏi các nhóm hợp chất tự nhiên khác Aavonoid, coumarin, glycosid... thì có thể sử dụng một số phương pháp được gọi là các 9 phương pháp chung chiết xuất alcaloid và thu được hỗn hợp alcaloid toàn phần. Từ hỗn hợp alcaloid toàn phần để tách riêng từng alcaloid ta phải dựa vào tính chất riêng của mỗi alcaloid mà có phương pháp thích hợp. sau Alcaloid base dễ tan trong dm hữu cơ, không tan trong nước, ngược lai alcaloid dưới dạng muối không tan trong dm hữu cơ và tan trong nước. [8] Như ta biết alcaloid có thể ở trạng thái rắn strychnin, morphin, codein... và ở trạng thái này trong phân tử thường chứa oxy. Ngoài ra, alcaloid có thể ở dạng lỏng nicotin, spactein,... và ở trạng thái này trong phân tử thường không có chứa oxy. Các alcaloid ở thể lỏng ngoài các phương pháp chung chiết xuất còn có thể chiết tách bằng phương pháp cất kéo hơi nước. Với những alcaloid ở thể rắn người ta sử dụng hai phương pháp chiết xuất chung sau - Phương pháp chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu cơ a - Chiết alcaloid base bằng dm hữu cơ không phân cực - Giai đoan 1 Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô để tăng khả năng chiết ta phải xay nhỏ dược liệu trước khi chiết nhằm làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa hai pha rắn và lỏng đẩy nhanh quá trình khuếch tán. Tuy nhiên nếu ta xay nhỏ dược liệu quá, dm sẽ khó chuyển động qua khối dược liệu và rất khó thu được dịch chiết do đó tuỳ thuộc vào từng loại dược liệu ta có thể xay nhỏ khác nhau để vừa đảm bảo đẩy nhanh quá trình khuếch tán vừa dễ dàng trong rút dịch chiết. Mặt khác nếu xay dược liệu nhỏ quá làm các tế bào bị dập nát nhiều, do đó dịch chiết sẽ kéo theo nhiều tạp chất ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. [1] Kiềm hoá Kiềm hoá và làm trương nở nguyên liệu bằng dung dịch kiềm thường dùng CaOH2, NH4OH, Na2C 03... để chuyển alcaloid trong nguyên liệu sang dạng base. - Giai đoan 2 Chiết xuất Dùng dm hữu cơ không phân cực thích hợp, dm này hoà tan các alcaloid base vừa được giải phóng. Ở phòng thí nghiệm thường dùng benzen, cloroíorm, ether hoặc hỗn hợp ether và cloroíorm. Có thể chiết nguội hoặc chiết nóng. [1,4] 10 - Giai đoan 3 Tinh chế Nguyên tắc Chuyển alcaloid nhiều lán từ dm hữu cơ sang dm nước và ngược lại w- -để loại các tạp chất không phải là alcaloid. Cuối cùng bốc hơi dm thu được hỗn hợp alcaloid base tinh khiết - gọi là alcaloid toàn phần Sơ đồ chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu c ơ •Ưu điểm - Dịch chiết sạch, dễ tinh chế loại các tạp kèm theo do đó hiệu suất chiết cao. 11 - Dm hữu cơ không phân cực thường có khả năng chiết chọn lọc với các alcaloid base. • Nhược điểm - Dm hữu cơ thường đắt tiền, dễ cháy. - Sử dụng dm hữu cơ đòi hỏi phải có thiết bị kín đ hơi dm, có biện pháp thu hồi dm do đó đầu tư cho thiết bị lớn. • ứng dụng Phương pháp này được dùng phổ biến trong chiết xuất alcaloid, đặc biệt với các dược liệu có nhiều chất nhày, pectin, tinh bột... dễ trương nở trong nước. b - Chiết xuất alcaloid base bằng dm hữu cơ phân cực ịethanol, methanol... Do dm hữu cơ phân cực ethanol, methanol... hoà tan alcaloid ở cả dạng muối và dạng base nên có thể sử dụng để chiết alcaloid dưới dạng base. Tuy nhiên nếu dùng dm phân cực để chiết alcaloid thì tuỳ vào bản chất của dược liệu mà dịch chiết có thể kéo theo nhiều tạp chất hơn so với sử dụng dm hữu cơ không phân cực. Và trong khâu tinh chế không thể chuyển trực tiếp alcaloid base sang dạng muối bằng cách dùng nước acid để chiết alcaloid từ pha dm hữu cơ chiết lỏng/lỏng mà phải cất thu hồi dm trước khi chuyển sang dạng muối và chiết bằng nước hoặc dùng một dm không phân cực chiết nó từ dịch cô đặc sau khi loại dm chiết. - Chiết xuất alcaloid dưới dạng muối muối tự nhiên hoặc muối với acid vô cơ bằng dm nước, nước acid hoặc các dm phân cực khác - Giai đoan 1 Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô như phương pháp Sau đó làm ẩm dược liệu cho trương nở bằng nước. - Giai đoan 2 Chiết xuất Dùng dm nước để chiết alcaloid ở dạng muối tự nhiên trong cây hoặc dùng dung dịch acid loãng để chiết alcaloid dưới dạng muối với acid vô cơ tương ứng, hoặc dùng dm là methanol và ethanol để chiết xuất alcaloid dưới dạng muối tự nhiên. - Giai đoan 3 Tinh chế Trong trường hợp chiết bằng nước, từ dịch chiết thô alcaloid base được giải phóng bằng cách thêm kiềm sau đó được chiết bằng một dm hữu cơ không hoà tan 12 trong nước. Tiếp tục tinh chế bằng cách bốc hơi dm và kết tinh lại trong dm hữu cơ hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. Trong trường hợp chiết bằng ethanol, dịch chiết ethanol được cô đặc, thêm acid và loại các tạp chất bằng các dm hữu cơ không phân cực, thêm kiềm chuyển alcaloid sang dạng base rồi chiết alcaloid base bằng một dm hữu cơ thích hợp. Bốc hoi dm hữu cơ, kết tinh alcaloid hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. • Ưu điểm - Dm rẻ tiền, dễ kiếm. - Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít. • Nhược điểm - Dịch chiết thường lẫn nhiều tạp do đó khó tinh chế, hiệu suất thấp. - Với những dược liệu có nhiều chất nhầy, pectin, tin nước trương nở, làm tăng độ nhớt do đó khó chiết, khó rút dịch chiết. • ứng dụng Với các dược liệu có ít tạp tan trong nước, trong dung môi phân cực. Các phương pháp chung đã nêu ở trên có kết quả tốt đối vói phần lớn các alcaloid trong dược liệu, nhưng một số alcaloid ở dạng base lại tan nhiều trong nước ephedrin, colchicin... hoặc ở dạng muối ít tan trong nước berberin clorid... tan trong dm hữu cơ resecpin hydroclorid tan trong cloroform thì người ta phải có cách chiết riêng cho thích hợp. - Các phương pháp tách alcaloid dưói dạng tinh khiết Từ hỗn hợp alcaloid toàn phần thu được ở giai đoạn tinh chế để tách riêng từng alcaloid dưới dạng tinh khiết có nhiều phương pháp khác nhau như thăng hoa, cất, giải phóng phân đoạn, kết tinh phân đoạn, sắc ký hấp phụ... Tuỳ vào tính chất của alcaloid cần tách mà lựa chọn phương pháp thích hợp. - Chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền - phương pháp chiết xuất strychnin ở Việt Nam - Strychnin đã được chiết xuất công nghiệp từ lâu và phương pháp mà xí nghiệp 2 thực hiện là chiết nóng với dm dầu hoả, dịch chiết sau đó được khuấy với dd H2S04 3% và gạn thu lấy lớp acid, dm đem thu hồi để chiết tiếp mẻ sau. Lớp acid được kiềm hóa bằng dd Na2C 0 3 bão hoà để tạo tủa alcaloid toàn phần. Lọc thu lấy tủa, rồi tiến hành loại brucin bằng cách chuyển sang dạng muối nitrat, strychnin 13 nitrat kết tinh còn brucin nitrat thì ở trong nước cái. Lọc thu lấy tinh thể strychnin nitrat đem tẩy màu bằng than hoạt, sau đó chuyển sang dạng muối sulíat. [2] - Quy trình thực tập trước đây của bộ môn Công nghiệp dược là dùng benzen để chiết xuất tiến hành tương tự như chiết bằng dầu hoả như trên nhưng chiết nguội. [3] - Phương pháp chiết xuất strychnin trên thế giói Quy trình của tác giả p. H. List và cộng sự Các tác giả chiết strychnin base bằng dm hữu cơ phân cực rồi cô thu hồi dm và tách strychnin dưới dạng muối HN03. [10] 14 PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ - Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm - Nguyên vật liệu - Nguyên liệu Hạt Mã tiền Strychnos nux -vomica L. đã được phơi khô. - Hoá chất và dm - Ethanol. - Dầu hoả. - Sữa vôi. - Na2C 0 3. - H2S04. - H N 03. - Cloroform. - Và các hoá chất khác HC1, NaOH, acid acetic,.. .• - Trang thiết bị - Dụng cụ chiết nóng. - Bình gạn 500 ml. - Máy quang phổ u v - VIS. - Máy cất thu hồi dm. - Máy siêu âm. - Máy đo góc quay cực. - Tủ sấy. - Các dụng cụ khác Bếp điện, cốc có mỏ, ống đong, bình gạn 125 m l,... - Phương pháp thực nghiệm - Định lượng strychnin trong hạt Mã tiền Bằng phương pháp đo quang theo DĐVNIII. Cân chính xác khoảng 0,4g dược liệu qua rây số 355 vào bình nón nút mài lOOml. Thêm chính xác 20ml cloroíorm và 0,3ml amoniac đậm đặc. Đậy kín bình 15 Nghiên cứu định lượng strychnin và brucin bằng phương pháp HPLC trong alkaloid tổng chiết từ hạt mãPublished on Jan 14, 2020About"Nghiên cứu định lượng strychnin và brucin bằng phương pháp HPLC trong alkaloid tổng chiết từ hạt mã tiền 2018"

định lượng strychnin trong hạt mã tiền